Comparison of three different methods for 25(OH)-vitamin D determination and vitamin D status in general population: Serbian experience

Abstract

Determination of 25-hydroxyvitamin D [25(OH)D] represents a unique challenge, considering its lipophilic nature. Considering the widespread prevalence of vitamin D deficiency, which leads to increasing number of requests for 25(OH)D determination, immunoassay measurements adjusted to automated analyzers are being developed. Because of the variability among assays, it is often difficult to monitor vitamin D status and supplementation. The aim of this study was to compare the results of two immunoassays with high performance liquid chromatography with ultraviolet detection (HPLC-UV). Also, the aim was to estimate vitamin D status, since up to date the prevalence of vitamin D deficiency in Serbia was not examined. We have evaluated analytical characteristics of two automated immunoassays for 25(OH)D determination, from Roche (Cobas® e601) and Abbott (Architect). For comparison studies we used HPLC analysis of 25-(OH)-Vitamin D3/D2 from Chromsystems (Waters isocratic system). In order to estimate vitamin D status in general population, we have searched the database of the laboratory information system and analyzed the data from 533 patients whose 25(OH)D was determined together with intact parathyroid hormone (iPTH). For imprecision assessment, four serum pools were prepared with following 25(OH)D concentrations: 35 nmol/L, ?50 nmol/L, ?75 nmol/L and ?125 nmol/L. Obtai ned CVs for Roche method were 1.5-2.8% for within-run and 4.0-6.7% for between-run imprecision. For Abbott method, CVs were 0.7-4.4% for withinrun and 3.8-7.2% for between-run imprecision. Inaccuracy was analyzed with commercial control sera. Obtained deviations from target value were 2.1% for Roche assay and 1.3-1.5% for Abbott method, and were not statistically significant (P>0.05). Comparison of Roche and HPLC-UV methods using Passing-Bablok regression analysis gave the following equation for the regression line y=0.937x+9.518 (r=0.739; n=97) and the regression line equation from the comparison of Abbott and HPLC-UV methods was y=0.745x+10.343 (r=0.793; n=97). Mean difference and SD for Bland-Altman plot were -4.5 nmol/L and 21.75 nmo/L, respectively for Roche method and 6.4 nmol/L and 18.8 nmol/L, respectively for Abbott. Statistical analysis (Chi-square test) of frequency distribution among different vitamin D status categories ( lt 25 nmol/L severe deficiency, 25-50 nmol/L deficiency, 50-75 nmol/L insufficiency and >75 nmol/L sufficiency) showed that the frequency distribution obtained with Abbott method was significantly different from the distribution of the HPLC results, in contrast to Roche results frequency distribution which did not differ significantly. Also, statistical analysis of the agreement between the three methods for each vitamin D status category showed that results of both Roche and Abbott methods were significantly higher than HPLC in the two deficiency categories (P=0.005 for Roche, P=0.0407 for Abbott), and in the sufficiency category Abbott method significantly underestimated concentration of 25(OH)D compared to HPLC results (P lt 0.0001). Median population values of 25(OH)D and iPTH were 41.8 nmol/L and 76.6 ng/L, respectively. ANOVA analyses showed significant (P lt 0.05) decrease in iPTH and Ca2+ concentrations across the 25(OH)D concentration categories. Stepwise multiple linear regression analysis indicated independent correlation of iPTH with 25(OH)D concentration (b=-0.290, P=0.0008). Also, one-way ANOVA with Student-Newman-Keuls test demonstrated that 25(OH)D concentrations measured in summer and autumn were significantly (P lt 0.001) higher compared to those determined in winter and spring. Despite acceptable imprecision and inaccuracy of both examined methods, results obtained with them did not correlate well with HPLC-UV (r lt 0.9), which was used as a reference. However, methods showed satisfactory ability to classify patients into vitamin D status categories, which is important for diagnosis of vitamin D deficiency and therapy follow-up. About two thirds (68.5%) of the examined population had vitamin D deficiency (25(OH)D lt 50 nmol/L) and only 8% had sufficient 25(OH)D concentration (>75 nmol/L).

Određivanje 25-hidroksivitamina D [25(OH)D] predstavlja jedinstven izazov, s obzirom da je visoko lipofilno jedinjenje. Visoka prevalencija deficijencije vitamina D uzrok je povećanja broja zahteva za određivanjem 25(OH)D, zbog čega se razvijaju imunohemijske metode prilagođene automatizovanim sistemima. Često je teško pratiti status vitamina D i suplementaciju zbog varijabilnosti između testova. Cilj ove studije bio je da se uporede rezultati dve imunohemijske metode sa tečnom hromatografijom visoke efikasnosti sa detekcijom u ultraljubičastom delu spektra (HPLC-UV). Takođe, cilj je bio i procena statusa vitamina D, pošto do sada nije ispitivana prevalencija deficijencije vitamina D u Srbiji. Ispitivane su karakteristike dve imunohemijske metode za određivanje 25(OH)D, proizvođača Roche (analizator Cobas® e601) i Abbott (na analizatoru Architect). Metode su poređene sa rezultatima HPLC analize korišćenjem 25-(OH)-Vitamin D3/D2 reagenasa firme Chromsystems (Waters izokratski sistem). Da bi se procenio status vitamina D u opštoj populaciji, pretražena je baza podataka laboratorijskog informacionog sistema i analizirani su rezultati 533 pacijenata kojima je određen 25(OH)D zajedno sa intaktnim paratiroidnim hormonom (iPTH). Pripremljena su četiri serumska pool-a sa koncentracijama 25(OH)D ? 35 nmol/L, ?50 nmol/L, ?75 nmol/L i ?125 nmol/L za procenu nepreciznosti imunohemijskih određivanja. Dobijeni koeficijenti varijacije za Roche metodu su se kretali u opsegu 1,5-2,8% u seriji i 4,0-6,7% između serija. Za Abbott metodu su koficijenti varijacije iznosili 0,7-4,4% u seriji i 3,8-7,2% između serija. Netačnost je ispitivana pomoću komercijalnih kontrolnih uzoraka. Dobijena odstupanja od deklarisane vrednosti su iznosila 2,1% za Roche i 1,3-1,5% za Abbott, i nisu bila statistički značajna (P>0,05). Poređenjem Roche i HPLC-UV metoda pomoću Passing-Bablok regresione analize dobijena je sledeća regresiona jednačina y=0,937x+9,518 (r=0,739; n=97), dok regresiona jednačina dobijena poređenjem Abbott i HPLC-UV metoda glasi y=0,745x+10,343 (r=0,793; n=97). Srednja vrednost razlika na Bland-Altman dijagramu razlika i standardna devijacija su iznosile -4,5 nmol/L i 21,75 nmo/L, redom, za Roche metodu i 6,4 nmol/L i 18,8 nmol/L, re dom, za Abbott metodu. Statistička analiza (Chi-kvadrat test) distribucije frekvencija među različitim kategorijama statusa vitamina D ( lt 25 nmol/L teška deficijencija, 25-50 nmol/L deficijencija, 50-75 nmol/L insuficijencija i >75 nmol/L preporučena koncentracija) je pokazala da je distribucija frekvencija dobijena Abbott metodom značajno različita od distribucije HPLC rezultata, za razliku od ras po dele frekvencija dobijene Roche metodom koja se nije značajno razlikovala. Takođe, statistička analiza slaganja između ispitivane tri metode u svakoj od kategorija statusa vitamina D je pokazala da su rezultati i Roche i Abbott metoda značajno veći od HPLC-UV u kategorijama deficijencije vitamina D (P=0,005 za Roche; P=0,0407 za Abbott), i u kategoriji sa preporučenom koncentracijom vitamina D Abbott metoda je značajno potcenjivala koncentraciju 25(OH)D u poređenju sa HPLC rezultatima (P lt 0,0001). Medijana za 25(OH)D u ispitivanoj populaciji bila je 41,8 nmol/L, i 76,6 za iPTH. ANOVA analiza je pokazala značajan pad (P lt 0,05) koncentracija iPTH i jonizovanog kalcijuma između kategorija koncentracija 25(OH)D. Multiplomlinearnom regresionom analizom utvrđena je ne zavisna korelacija između koncentracija iPTH i 25(OH)D (b =-0,290; P=0,0008). Takođe, ANOVA za jedan kriterijum klasifikacije sa Student-Newman-Keuls testom je pokazala da su koncentracije 25(OH)D određene u leto i jesen značajno više (P lt 0,001) u poređenju sa onima određenim u zimu ili proleće. Uprkos prihvatljivoj nepreciznosti i netačnosti obe ispitivane imunohemijske metode, dobijeni rezultati nisu u zadovoljavajućoj korelaciji sa HPLC-UV metodom (r lt 0,9), koja je korišćena kao referentna u ovom slučaju. Uprkos ovoj činjenici, metode su pokazale zadovoljavajuću sposobnost klasifikacije pacijenata u kategorije statusa vitamina D, što je važno za dijagnozu deficijencije vitamina D i praćenje terapije. Oko dve trećine (68,5%) ispitivane populacije je imalo deficijenciju vitamina D (25(OH)D lt 50 nmol/L) i samo 8% je imalo preporučenu koncentraciju 25(OH)D (>75 nmol/L).